Исследование интернализации контейнеров с антимикотиком клетками фибробластов методами визуализирующей проточной цитометрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

Разработка и оптимизация систем адресной доставки лекарственных веществ является активно развивающимся направлением фармацевтики. К важным свойствам, предъявляемым к разрабатываемым контейнерам-носителям, относится не только возможность доставки, высвобождения и локализации иммобилизованного терапевтического агента в зоне патологического изменения, но и безопасность применения для организма. Интернализация является одним из косвенных доказательств биосовместимости носителей, содержащих терапевтический агент, поскольку отражает результат их взаимодействия с клеткой. Сохранение жизнеспособности клетки после проникновения носителя внутрь свидетельствует о его безопасности. Таким образом, оценка эффективности захвата носителей различными клеточными линиями позволяет получить информацию об их биосовместимости. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия рутинно применяется для решения данной задачи. Однако такой метод обладает рядом недостатков, в числе которых высокая трудо- и времязатратность, не позволяющая получить большой массив данных в короткие сроки. Классические системы проточной цитофлуориметрии также широко применяются для оценки цитотоксичности и позволяют проанализировать до нескольких тысяч объектов в секунду. Однако подобные системы, в отличие от конфокальных лазерных сканирующих микроскопов, не позволяют получать изображения объектов и, как следствие, верифицировать полученные данные. Новое поколение проточных цитометров объединило в себе сильные стороны вышеупомянутых методов. Так, существующие на сегодняшний день системы проточной цитометрии с возможностью визуализации позволяют анализировать порядка 5000 объектов в секунду, предоставляя при этом их флуоресцентные и светлопольные изображения. Однако стоит отметить, что применение гидродинамической фокусировки объектов в фокальной области объектива, используемого для визуализации, не исключает возможности их флуктуаций в потоке и, как следствие, не позволяет сделать однозначный вывод о локализации носителей в пределах клетки. Кроме того, анализ интернализации носителей, обеспечивающих пролонгированную доставку лекарственного средства, при использовании данного метода затруднен по причине накопления высвобождаемого из носителя флуоресцентно меченного препарата в эндосомах клетки. Для решения данной проблемы нами была проведена оптимизация протокола оценки частиц методом визуализирующей проточной цитофлуориметрии. Изучался захват субмикронных частиц ватерита клетками дермальных фибробластов мыши. Сравнительное исследование захвата частиц клетками с помощью методов конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и визуализирующей проточной цитофлуориметрии продемонстрировало отличную корреляцию полученных данных. Высокая пропускная способность метода проточной цитометрии в сочетании с оптимизированным алгоритмом анализа по определению локализации частиц в клетке позволяет осуществлять быструю оценку качества интернализации исследуемого образца.