Влияние рассеяния на предельную глубину визуализации в методе двухфотонной флуоресцентной микроскопии

На основе теоретической модели распространения сфокусированного пучка света в сильно рассеивающей среде обсуждаются различные факторы, ограничивающие возможности двухфотонной флуоресцентной микроскопии (ДФМ) для наблюдения глубинной структуры оптически толстых образцов биологических тканей. Выделены три основные причины ограничения глубины наблюдения методом ДФМ: 1) размытие пучка в результате многократного малоуглового рассеяния, приводящее к потере субмикронного поперечного разрешения; 2) избыточная засветка приповерхностной области объекта, возникающая при наблюдении глубоко расположенных структур в результате увеличения средней мощности источника для компенсации потерь из-за рассеяния; 3) снижение уровня полезного сигнала двухфотонной флуоресценции из-за экспоненциального ослабления мощности накачки. Влияние указанных факторов было рассмотрено в рамках малоуглового диффузионного приближения теории переноса излучения. Показано, что первые два ограничения определяют фундаментальный предел ДФМ, в то время как последнее ограничение является инструментальным пределом и представляется наиболее критичным в современных коммерческих установках лазерной сканирующей микроскопии для подавляющего большинства используемых флуорофоров.